क्यूजेन क्यूआईएक्यूइटी ईजी पीसीआर किट यूजर मैनुअल
यह प्रोटोकॉल डिजिटल पीसीआर के लिए क्यूजेन के क्यूआईएक्यूटी उपकरणों का उपयोग करके सिंगलप्लेक्स प्रतिक्रिया में डीएसडीएनए-बाइंडिंग डाई ईवाग्रीन® के साथ क्यूआईएक्यूइटी ईजी पीसीआर किट (बिल्ली संख्या 250111, 250112, और 250113) का उपयोग करके डीएनए या सीडीएनए लक्ष्यों की मात्रा के लिए अनुकूलित है। डीपीसीआर)। QIAcuity EG PCR किट प्राप्त होने पर तुरंत -30 से -15°C पर एक स्थिर-तापमान फ्रीजर में संग्रहीत किया जाना चाहिए और प्रकाश से सुरक्षित होना चाहिए। QIAcuity EG PCR मास्टर मिक्स को 2–8°C पर प्रकाश से सुरक्षित रखा जा सकता है। जब तक अन्यथा लेबल पर इंगित नहीं किया जाता है, घटक इन शर्तों के तहत प्रदर्शन में कोई कमी दिखाए बिना 6 महीने तक स्थिर रहते हैं। विभिन्न प्रकार के QIAGEN के QIAcuity dPCR परख के लिए समर्पित प्रोटोकॉल उनके संबंधित त्वरित-प्रारंभ प्रोटोकॉल और QIAcuity उपयोगकर्ता मैनुअल एक्सटेंशन: एप्लिकेशन गाइड में पाए जा सकते हैं।
अधिक जानकारी के
- QIAcuity यूजर मैनुअल एक्सटेंशन: एप्लिकेशन गाइड: www.qiagen.com/HB-2839
- QIAcuity उपयोगकर्ता पुस्तिका: www.qiagen.com/HB-2717
- सेफ्टी डेटा शीट: www.qiagen.com/safety
- तकनीकी सहायता: support.qiagen.com
शुरू करने से पहले नोट्स
- DPCR नैनोप्लेट्स में भरने वाले उचित विभाजन का विश्वसनीय पता लगाने के लिए QIAcuity EG PCR मास्टर मिक्स के एक घटक के रूप में एक फ्लोरोसेंट रेफरेंस डाई प्रदान की जाती है।
- dPCR में उच्चतम दक्षता के लिए, ampलाइसेंस की लंबाई आदर्श रूप से 60−150 बीपी होनी चाहिए। क्यूपीसीआर के समान, लंबा ampलाइसेंस का भी उपयोग किया जा सकता है; हालाँकि, परख
प्रदर्शन बिगड़ सकता है। - इस प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट सायक्लिंग स्थितियों और प्राइमर सांद्रता के साथ हमेशा प्रारंभ करें।
- मास्टर मिक्स में QuantiNova® DNA पोलीमरेज़ को सक्रिय करने के लिए PCR को 2°C पर 95 मिनट के प्रारंभिक ऊष्मायन चरण के साथ शुरू करना चाहिए।
- उपयोग में आसानी के लिए, हम 10x या अधिक केंद्रित प्राइमर मिश्रण तैयार करने की सलाह देते हैं। एक 10x प्राइमर मिश्रण में कम ईडीटीए (4 एमएम) के साथ टीई बफर में 4 माइक्रोन फॉरवर्ड प्राइमर और 0.1 माइक्रोन रिवर्स प्राइमर होते हैं।
- 2-स्टेप RT-PCR के लिए, cDNA को संश्लेषित करने के पहले चरण के लिए QuantiTect® रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किट का उपयोग करें।
महत्वपूर्ण: QuantiNova रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किट की अनुशंसा नहीं की जाती है।
क्वांटिक्ट रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किट का उपयोग करने पर जोड़े गए सीडीएनए की मात्रा (अनडाइल्यूटेड रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन रिएक्शन से) अंतिम पीसीआर वॉल्यूम के 10% से अधिक नहीं होनी चाहिए। यदि दूसरी RT किट का उपयोग कर रहे हैं तो यह 5% से अधिक नहीं होनी चाहिए।
टेम्पलेट डीएनए पाचन
- डीएनए एसampएक औसत लंबाई ≥20 kb के साथ (उदाहरण के लिए, सिलिका झिल्ली के साथ स्पिन कॉलम के माध्यम से शुद्ध जीनोमिक डीएनए, या सॉल्टिंग आउट विधि) को विभाजन से पहले प्रतिबंध पाचन द्वारा खंडित किया जाना चाहिए। बड़े डीएनए का एंजाइमैटिक विखंडन पूरे QIAcuity नैनोप्लेट में टेम्प्लेट का समान वितरण सुनिश्चित करता है, जिसके परिणामस्वरूप सटीक और सटीक परिमाणीकरण होता है।
- प्रतिबंध डाइजेस्ट के माध्यम से डीएनए का विखंडन विशेष रूप से महत्वपूर्ण होता है जब प्रतिलिपि संख्या भिन्नता (सीएनवी) विश्लेषण किया जाता है, जहां एक जीन की कई प्रतियों को मिलकर जोड़ा जा सकता है। अत्यधिक खंडित डीएनए (जैसे, एफएफपीई डीएनए या परिसंचारी डीएनए) या सीडीएनए के लिए प्रतिबंध पाचन की आवश्यकता नहीं है।
- ऐसे एंजाइमों का उपयोग करने के लिए सावधानी बरतनी चाहिए जो भीतर नहीं कटेंगे ampपरिशोधित अनुक्रम। QIAGEN के CNV और म्यूटेशन डिटेक्शन एसेज़ के लिए, उपयुक्त जानकारी geneglobe.qiagen.com पर देखी जा सकती है।
- संकेतित सांद्रता पर QIAcuity रिएक्शन मिक्स में सीधे जोड़े जाने पर निम्नलिखित मान्य एंजाइम कमरे के तापमान (10−15°C) पर डीएनए को 25 मिनट में डाइजेस्ट कर लेंगे।
तालिका 1. मान्य प्रतिबंध एंजाइम
| 6-कटर प्रतिबंध एंजाइम 4-कटर प्रतिबंध एंजाइम | |||||
| पारिस्थितिकीRI | 0.25 यू/μl EcoRI-HF®, NEB® | अरिथमेटिक लॉजिक यूनिटI | 0.025 यू/μl एलयूआई, एनईबी | ||
| 0.025 U/μl Anza™ 11 EcoRI, थर्मो फिशर साइंटिफिक | 0.025 यू/माइक्रोन अंज़ा 44 अलुआई, थर्मो फिशर साइंटिफिक | ||||
| पवुII | 0.025 यू/μl PvuII, एनईबी | छवीQI | 0.025 यू/μl सीवीआईक्यूआई, एनईबी | ||
| 0.025 U/μl Anza 52 PvuII, थर्मो फिशर साइंटिफिक | 0.025 U/μl Csp6I (CviQI), थर्मो फिशर साइंटिफिक | ||||
| एक्सबाI | 0.025 U/μl Anza 12 XbaI, थर्मो फिशर साइंटिफिक | हाएतृतीय | 0.025 U/μl BsuRI (HaeIII), थर्मो फिशर साइंटिफिक | ||
प्रक्रिया
प्रतिक्रिया सेटअप
- QIAcuity EG PCR मास्टर मिक्स, टेम्पलेट DNA या सीडीएनए, प्राइमर, और RNase-मुक्त पानी को पिघलाएं। व्यक्तिगत समाधान मिलाएं।
- टेबल 2 के अनुसार रिएक्शन मिक्स तैयार करें। हॉट-स्टार्ट पोलीमरेज़ के कारण एस रखना जरूरी नहीं हैampप्रतिक्रिया सेटअप के दौरान या QIAcuity उपकरण की प्रोग्रामिंग करते समय बर्फ पर लेस।
तालिका 2. रिएक्शन सेटअप
| मात्रा/प्रतिक्रिया | |||
|
घटक |
नैनोप्लेट 8.5k (24-वेल, 96-वेल) | नैनोप्लेट 26k (24-वेल) | अंतिम एकाग्रता |
| 3x ईवाग्रीन पीसीआर मास्टर मिक्स (एफएएम चैनल) | 4 μl | 13.3 μl | 1x |
| 10x प्राइमर मिक्स | 1.2 μl* | 4 μl* | 0.4 माइक्रोन फॉरवर्ड प्राइमर
0.4 माइक्रोन रिवर्स प्राइमर |
| प्रतिबंध एंजाइम (वैकल्पिक) | 1 μl तक | 1 μl तक | 0.025–0.25 यू/μl |
| RNase मुक्त पानी | परिवर्तनीय | परिवर्तनीय | |
| टेम्पलेट डीएनए या सीडीएनए (चरण 4 में जोड़ा गया) | चर† | चर† | |
| कुल प्रतिक्रिया मात्रा | 12 μl | 40 μl |
- उपयोग किए गए प्राइमर मिश्रण की एकाग्रता के आधार पर मात्रा भिन्न हो सकती है।
- उपयुक्त टेम्पलेट राशि विभिन्न मापदंडों पर निर्भर करती है। विवरण के लिए कृपया QIAcuity यूजर मैनुअल एक्सटेंशन: एप्लिकेशन गाइड देखें।
- प्रतिक्रिया मिश्रण भंवर।
- एक मानक पीसीआर प्लेट के कुओं में, प्रतिक्रिया मिश्रण, जिसमें टेम्पलेट को छोड़कर सभी घटक शामिल हैं, की उचित मात्रा का वितरण करें। फिर, प्रतिक्रिया मिश्रण वाले प्रत्येक कुएं में टेम्पलेट डीएनए या सीडीएनए जोड़ें।
नोट: प्रतिक्रिया मिश्रण और टेम्पलेट डीएनए की उचित मात्रा विभिन्न मापदंडों पर निर्भर करती है। विवरण के लिए कृपया QIAcuity यूजर मैनुअल एक्सटेंशन: एप्लिकेशन गाइड देखें। - प्रत्येक कुएं की सामग्री को मानक पीसीआर प्लेट से नैनोप्लेट के कुओं में स्थानांतरित करें ।
- QIAcuity नैनोप्लेट किट में प्रदान की गई QIAcuity नैनोप्लेट सील का उपयोग करके नैनोप्लेट को ठीक से सील करें।
नोट: सटीक सीलिंग प्रक्रिया के लिए, कृपया QIAcuity सिस्टम यूजर मैनुअल देखें। - डीएनए पाचन के लिए एक प्रतिबंध एंजाइम प्रतिक्रिया में शामिल किया गया है, तो 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर थाली छोड़ दें।
थर्मल साइकलिंग की स्थिति
- QIAcuity इंस्ट्रूमेंट के साइक्लर को तालिका 3 के अनुसार प्रोग्राम करें।
तालिका 3. साइकिल चलाने की स्थिति
| कदम | पहर | तापमान (डिग्री सेल्सियस) |
| पीसीआर प्रारंभिक गर्मी सक्रियण | 2 मिनट | 95 |
| 3-स्टेप साइकिलिंग (40 साइकिल) | ||
| विकृतीकरण | है 15 | 95 |
| एनीलिंग | है 15 | 55-62* |
| विस्तार | है 15 | 72 |
| शांत होते हुए | 5 मिनट | 40 |
एनीलिंग/विस्तार के दौरान तापमान और चक्रों की संख्या परख प्रकार के आधार पर भिन्न हो सकती है। नैनोप्लेट को QIAcuity इंस्ट्रूमेंट में रखें और dPCR प्रोग्राम शुरू करें।
दस्तावेज़ संशोधन इतिहास
| तारीख | परिवर्तन |
| 07/2020 | आरंभिक रिलीज |
| 01/2021 | अपडेट किया गया URL of QIAcuity यूजर मैनुअल एक्सटेंशन: एप्लिकेशन गाइड. |
अप-टू-डेट लाइसेंसिंग जानकारी और उत्पाद-विशिष्ट अस्वीकरणों के लिए, संबंधित देखें
क्यूजेन किट हैंडबुक या उपयोगकर्ता पुस्तिका
ट्रेडमार्क: QIAGEN®, एसample to Insight®, QIAcuity®, QuantiNova®; QuantiTect® (QIAGEN Group); ईवाग्रीन® (बायोटियम, इंक।); Anza™ (थर्मो फिशर साइंटिफिक या इसकी सहायक कंपनियां); -एचएफ®, एनईबी® (न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स, इंक।)। इस दस्तावेज़ में उपयोग किए गए पंजीकृत नाम, ट्रेडमार्क इत्यादि, भले ही विशेष रूप से चिह्नित न हों, उन्हें कानून द्वारा असुरक्षित नहीं माना जाना चाहिए। 1123717 01/2021 HB-2791-003 © 2021 QIAGEN, सर्वाधिकार सुरक्षित। 4ओ आदेश www.qiagen.com/shop | तकनीकी समर्थन support.qiagen.com | Webसाइट wQIwAwc.uiqityag
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